Developing innovative approaches using the QPCR method for the detection of spore-forming bacilli of the bacillaceae and anoxybacillaceae families that cause contamination in the process of milk and dairy products
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Fen Bilimleri Enstitüsü (Döner Sermaye), Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2025
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: AYŞE BÜŞRA KARAKAYA
Danışman: Arzu Çöleri Cihan
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Tez kapsamında öncelikle süt/süt ürünleri kontaminantı olarak bilinen 65 Bacillaceae ve Anoxybacillaceae üyesine özgü gen dizileri (16S rRNA, rpoA, rpoB, gyrA, gyrB, spo0A, spo0B, spoIIIAB) kullanılarak yeni primer/prob tasarımları yapılmıştır. İlk olarak konvansiyonel PCR'la doğrulanan tasarımlardan 11'i seçilmiş, sonrasında ise hızlı ve hassas tespit amacıyla 7 sporlu basilin genomik DNA'larıyla qRT-PCR optimizasyonları yürütülmüş, iç ve dış grup çaprazlamalar sonucunda internal kontrolle birlikte en uygun 4 primer/prob seti seçilmiştir. Tekli (T) ve çoklu (Ç) qRT-PCR çalışmalarıyla seçilen 7 türün spor ve vejetatif hücrelerinin tespiti moleküler düzeyde gerçekleştirilmiştir. Buna göre Anoxybacillus; F81 (ET=%63, EÇ=%83) ve DSM 2641 (ET=%72, EÇ=%80), Geobacillus; DSM 465 (ET=%120, EÇ=%24) ve ATCC 43223 (ET=%118, EÇ=%80), Bacillus; DSM 1971 (ET=%86, EÇ=%88), DSM 13 (ET=%76, EÇ=%105) ve DSM 7 (ET=%66, EÇ=%113) cinsleri için kantitatif analizlerde lineer regresyon eğrileri ve etkinlik (%E) değerleri saptanmış, tespit edilebilirlikleri istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Sütten vorteksv/sonikasyons yöntemleriyle DNA izolasyonu sonucunda, kit kapsamında kullanılacak vorteksleme ile sırasıyla vejetatif hücre ve sporlardan 28-99 ve 30-1255 ng/µL genomik DNA izole edilebilmiş, qRT-PCR'daki üstünlüğü gösterilmiştir. Süt varlığında kültüre dayalı yöntemlerle tespit limitleri tüm temsilci türlerde 10²-10⁹ KOB/mL olarak belirlenirken, vorteks veya sonikasyonla sütten izole DNA'larla yürütülen qRT-PCR'da limitler Anoxybacillus için v ve s, 10⁴-10⁹; Geobacillus için v, 10³-10⁹ ve s, 10⁴-10⁹; Bacillus için v, 106-109 ile s, 10⁵-10⁹ KOB/mL olarak saptanmıştır. Böylece, Anoxybacillaceae (Anoxybacillus, Anoxybacteriodes, Thermoaerobacillus, Geobacillus, Parageobacillus) ve Bacillaceae (Bacillus) familyası üyelerini özgül olarak tespit edebilecek ticari bir kitin ön-tasarımı gerçekleştirilmiş, süt kontaminantı mikroorganizmaların hassas, hızlı ve güvenilir bir şekilde tespitine yönelik multipleks qRT-PCR temelli yenilikçi bir yaklaşım sunulmuştur.