Karbonik anhidraz enziminin deinococcus radiodurans'dan klonlanması, ekspresyonu ve biyokimyasal karakterizasyonu
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, BİYOLOJİ ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2016
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: AYŞE HÜMEYRA TAŞKIN KAFA
Danışman: ARZU ÇÖLERİ CİHAN
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Radyasyonun insanlar üzerine zararlı etkileri olmasına rağmen, yüksek seviyedeki iyonize radyasyon varlığında hayatta kalabilen, ekstremofil bakterilerden biri olarak bilinen Deinococcus radiodurans, kuruluk, oksidanlar, Ultra Viole Radyasyon (UVR) gibi aşırı strese olağanüstü karşı koyma yeteneğindedir. Bu çalışma kapsamında, D.radiodurans R1'in direnç fizyolojisinde önemli olduğunu düşündüğümüz hücre içi DrCA enziminin klonlanması, saflaştırılması ve kısmi karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca bakterinin çeşitli dozlarda gama radyasyon uygulaması ve farklı pH değerlerine sahip TGYB besiyerlerinde geliştirilmesi sonucunda radyasyon ve pH ile ilişkili DrCA enzim aktivitelerindeki değişimler belirlenmiştir. Bakterinin en iyi gelişim gösterdiği pH aralığı 6.75-7.75 olarak belirlenmiş ve 24 saat süresince DrCA enziminin en yüksek aktivite değişiminin olduğu pH değeri 7.0 olarak bulunmuştur. Radyasyon uygulaması sonrası DrCA aktivite sonuçlarında, ilk 800 Gy'a kadar aktivitenin 5.4 kat olacak şekilde sürekli arttığı, bu noktadan sonra aktivitede bir düşüş görüldüğü tespit edilmiştir. PCR ile çoğaltılan DrCA geni, pFN2K Flexi vektörüne klonlanmış ve sonuçlar dizi analizi ile de teyit edilmiştir. Sub-klonlama çalışmaları için E. coli DH5α ve protein ekspresyonu için ise E. coli BL21 (DE3) konakları kullanılmıştır Saflaştırma aşamasında MagneGST saflaştırma sistemi kullanılmış ve enzim %94.68 oranında yüksek bir verim ve 494.5 saflaştırma kat sayısı ile saflaştırılabilmiştir. Ayrıca rekombinant E.coli BL21 konağında enzimin spesifik hidrataz aktivitesi 0.109 U/mg iken, saf enzimin spesifik aktivitesi 5 kat artarak 0.539 U/mg olarak belirlenmiştir. Enzimin pH 9.0'de optimum aktivite ve termostabilite gösterdiği sıcaklık 30oC olarak bulunmuştur. Enzimin pH 8.0'de, 25oC'de en yüksek hidrataz aktivitesi gösterdiği saptanmıştır. Saf enzimin esteraz aktivitesi ise eser miktarda (0.0002 U/ml) bulunmuştur. Saf enzim üzerinde metal iyonlarından Zn+2 aktivatör, sülfonamid ise inhibitör etki göstermiştir. Saf enzimin pNP-asetat substrata afinitesinin çok düşük olduğu ve diğer β-DrCA'lar gibi CO2'e yüksek spesifite gösterdiği belirlenmiştir.