shRNA ile HBV replikasyonunun in vitro olarak baskılanması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, HEMATOLOJİ ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2005
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: HANDAN KAYHAN
Danışman: ABDURRAHMAN MİTHAT BOZDAYI
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:RNAi (RNA interference: RNA çatışması) kısaca sekans spesifik mRNA degradasyonu olarak tanımlanabilir. RNAi işlemi siRNA'larla (small interfering RNA: küçük engelleyici RNA molekülleri) başlar ve aktif bir gen transkriptinin (mRNA) susturulması (gene silencing) ile sonuçlanır. Bu moleküller çok spesifik olduklarından hedef mRNA dışında başka mRNA'ları yıkıma uğratmazlar. RNAi teknolojisi sadece virüslere ve diğer hastalıklara karşı potansiyel bir tedavi aracı olarak değil aynı zamanda genlerin fonksiyonunu anlamada da yeni ve güçlü bir araçtır. Bu çalışmanın amacı RNAi mekanizmasını HBV'ye karşı kullanmak yoluyla HBV replikasyonunun in-vitro ortamda baskılanmasıdır. MATERYAL VE YÖNTEM: HBV mRNA sekanslarına spesifik, 21 nükleotid uzunluğunda, X, kor ve yüzey genlerini hedef alan üç siRNA tasarlandı. Bu siRNA'lar shRNA ("small hairpin RNA") ekspresyonu sağlamak için klonlandı. İlk olarak siRNA'ların pENTR/U6 vektörüne ligasyonu yapıldı. Elde edilen bu vektör kompetent E. Coli'ye transforme edildi. Klonlama sekans analizi ile onaylandı. shRNA'ların HBV üzerindeki etkisini görmek için stabil HBV ekspresyonu ve replikasyonunun yapıldığı insan hepatoma hücre hattı HepG.2.2.15 kullanıldı. Transfeksiyon katyonik lipozomlarla gerçekleştirildi. Transfekte edilen shRNA'ların HBV replikasyon düzeyine etkisi kantitatif "real-time PCR" yöntemi ile değerlendirildi. BULGULAR: Viral DNA düzeyine 2., 3., 4., 5., 6. ve 7. günlerde bakıldı. Bunun sonucunda viral DNA replikasyonunun 6 gün boyunca baskılandığı görüldü. HBV DNA düzeyi, yüzey bölgesini hedef alan plazmidle 81%, kor bölgesini hedef alan plazmidle 76% ve X bölgesini hedef alan plazmidle 75 % baskılandı. SONUÇ: Bu çalışma ile HBV replikasyonun shRNA'lar kullanılarak baskılanabildiği gösterilmiştir. Bu baskılama RNAi'nin HBV'ye karşı potansiyel bir tedavi aracı olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir. Anahtar sözcükler: RNAi, siRNA, shRNA, HBV, HepG2.2.15 hücre hattı. 77