Holstein ırkı sığırlarda aborta ve yavru kayıplarına neden olan bazı kalıtsal hastalıkların tespiti için multipleks RT-PCR kiti geliştirilmesi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, VETERİNERLİK BİYOKİMYASI ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2025
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: BURAK SEZER
Danışman: Öğünç Meral
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Dünya çapında, genetik kütüphanenin genişlemesi ve yüksek verimli hayvanların ıslahı için yapılan çalışmaların hız kazanmasıyla birlikte, morfolojik seleksiyon yerine çeşitli moleküler metotlarla yapılan seleksiyon çalışmaları sahadaki önemini artırmıştır. Damızlık olarak seçilen yüksek verimli boğaların spermaları, boğa besleme maliyetlerinden tasarruf etmek, depolama kolaylığı ve geniş coğrafyalarda kolaylıkla kullanımına elverişli olması açısından saklanmaya ve dünya çapında yayılmaya başlamıştır. Ancak bu durum genotipik çeşitliliğin azalmasına ve çeşitli kalıtsal hastalıkların dünya çapındaki frekanslarının artmasına neden olmuştur. Bu durum hayvancılık sektörünü ve dolayısıyla hayvansal gıdaların üretimi hususunu olumsuz yönde etkilemektedir. Özellikle süt işletmelerinde süt üretiminin yanında eşit derecede önemli olan bir diğer şey de yavru alımıdır. Ancak embriyonal ve fötal ölümlere, abortlara ve yavru kayıplarına neden olan kalıtsal hastalıkların frekansının artması, döl verimi ve yavru sağlığını da tehlike altına sokmuştur. Sığır lökosit bağlanma hastalığı (bovine leucocyte adhesion deficiency, BLAD), kompleks vertebral malformasyon (Complex vertebral malformation, CVM), Brahispina ve HH1, HH2, HH3 haplotipleri özellikle Holştayn ırkı sığırlarda arilik istenen hastalıklardır. Bu hastalıklardan arilik konusu Tarım ve Orman Bakanlığı tarafından da özellikle sıkı bir şekilde takip edilmektedir. Belirtildiği gibi moleküler tanı tekniklerinin sağladığı avantajlardan ıslah çalışmalarında da yararlanmak son derece rasyonel bir seçenektir. Bu tekniklerden gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Real time PCR, RT-PCR), genetik tanı alanında en yaygın kullanılanlardan biridir. Bu çalışmada, literatürlere konu olan kalıtsal hastalıkların tespiti amacıyla üretilecek olan kitin de bu tekniğe uygun olarak geliştirilmesi ve ilgili kalıtsal hastalıklar arasından seçilen altı tanesinin tespitinin gerçek zamanlı olarak gerçekleştirildiği bir multipleks RT-PCR kiti tasarlanması amaçlanmıştır. Her bir haplotipin yabanıl ve mutant alelleri için sentetik pozitif kontrol oligonükleotitleri, primerler ve özgül problar tasarlanmıştır. HHB, HHC, HH1, HH2, HH3 hedeflerinin her biri için ortak birer ileri ve geri primer kullanılmıştır. HH0 mutant aleli 3,3 kb gibi büyük delesyon içerdiğinden yabanıl ve mutant tipler için ayrı primer setleri tasarlanmıştır. Optimizasyon çalışmalarına geleneksel tekli PCR yöntemi ile başlanmış ve amplifikasyon ürünleri jelde görüntülenip reaksiyon sonucu oluşan amplikonlar doğrulanmıştır. Her bir haplotipin iki alelinin aynı reaksiyonda analizi için amplifikasyon sonucu yıkımlanarak ışıma yapması prensibiyle çalışan florofor işaretli hidroliz probları kullanılmıştır. Reaksiyon kuyusunda bir arada teşhis edilecek her bir haplotipe ait iki alel için tasarlanan problardan biri FAM diğeri HEX boyalarla işaretlenmiştir. Tekli gerçek zamanlı kantitatif PCR (RT-qPCR) çalışmalarıyla reaksiyon verimliliği incelenmiştir. Verimlilik ve saptama limiti tespitinde standart eğriye ilişkin parametreler kullanılmıştır. İkili qPCR'da ise kullanılan heterozigot, heterozigot mutant, homozigot yabanıl, negatif kontroller ve kalıp içermeyen kontrol grupları kullanılarak parametrelerin genomik DNA amplifikasyon parametreleriyle karşılaştırılması yapılmış ve end point analiziyle yorumlanmıştır. Bir qPCR çalışmasında karşılanması beklenen Cq, etkinlik, standart eğim, LOD ve LOQ değerleri, standart eğrinin regresyon analizinden faydalanılarak istenen aralıkta saptanmıştır.