Microsporum canis ve Trichophyton mentagrophytes teşhisine yönelik LAMP kiti geliştirilmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, VETERİNERLİK MİKROBİYOLOJİSİ ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2019
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: GÜLTEKİN ÜNAL
Danışman: HAMİT KAAN MÜŞTAK
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bu tez çalışmasında hayvanlardan en çok izole edilen dermatofit etkenleri olan M.canis ve T.mentagrophytes'in, klinik örneklerden hızlı teşhisine yönelik bir LAMP yönteminin geliştirilmesi ve sonrasında geliştirilen bu yöntemin saha şartlarında uygulanabilirliğinin gösterilmesi hedeflendi. Çalışmada, yöntemde kullanılmak üzere primer tasarımı için CHS-1 gen bölgesi seçildi. Bu gen bölgesine yönelik tasarlanan primerler ile süre optimizasyonu yapıldı. Süre optimizasyonundan sonra geliştirilen LAMP yöntemi referans materyaller ile denendi. Yöntemin özgül ve duyarlı olduğu belirlendi. Tüm deneylere, çıplak gözle objektif olarak değerlendirmeye olanak sağlayan HNB boyası eklenerek ve reaksiyon süresi sonunda renk değişimi objektif olarak değerlendirildi. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı'na gönderilen konvansiyonel mikolojik ekim yöntemi ile teşhisi yapıldıktan sonra kültürlerden izole edilmiş 108 (64 M.canis, 44 T.mentagrophytes) adet DNA ile geliştirilen yöntem denendi. Bu denemeden sonra LAMP yönteminin saha şartlarında kullanılabilirliğini arttırmak amacıyla geliştirilen kıl örneklerinden hızlı fungal DNA ekstraksiyonu yöntemi geliştirildi. Ankara Üniversitesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı stoklarında bulunan 100 adet kıl örneğiyle bu ekstraksiyon yönteminin ardından LAMP yöntemi uygulanarak valide edildi. Yapılan validasyon çalışmalarından elde edilen veriler yardımıyla geliştirilen yöntemin duyarlılığı ve özgüllüğü ve tekrarlanabilirliği hesaplandı. Yapılan çalışmalar sonucunda geliştirilen yöntemin kıl örneklerinden tespit limiti M.canis için 100 spor/ml, T.mentagrophytes için 100 spor/ml, kültür örneklerinden 10 spor/ml ve 10 spor/ml, DNA örneğinden 0,00048 ng/µl ve 0,00048 ng/µl olarak bulundu. Geliştirilen yöntem hazır DNA'lara uygulandığında özgüllüğün her iki etken için de %100, duyarlılığın M.canis için 96,87, T.mentagrophytes için 95,45 bulundu. Paralel olarak geliştirilen hızlı ekstraksiyon yöntemi ile yapılan çalışmada, özgüllüğün her iki etken için de %100, duyarlılığın M.canis için 94,73, T.mentagrophytes için 91,66 olduğu belirlendi. LAMP yöntemi ile konvansiyonel mikolojik yönteminin sonuçları ve bu tez kapsamında geliştirilen yöntemin sonuçları karşılaştırıldığında elde edilen sonuçlara göre geliştirilen yöntemin saha şartlarında uygulanabilir olduğu, duyarlılık ve özgüllük değerlerinin diğer yöntemler ile karşılaştırılabilir olduğu görüldü. Bu tez çalışmasında dünyada ilk defa 30 dk'da M.canis ve T.mentagrophytes'in teşhis edilebildiği duyarlı ve özgül bir LAMP yöntemi tasarlanmış oldu. Geliştirilen bu LAMP yönteminin M.canis ve T.mentagrophytes'in düşük bütçeli laboratuvarlar ve veteriner kliniklerinde hızlı, güvenilir, doğru bir şekilde teşhis edilebilmesini sağlayacağı ve teşhis ile tedavi arasında geçen sürenin minimuma indirilmesi sonucunda gereksiz ilaç kullanımının engellenebileceği ve tedavi başarısının arttırılmasını sağlayacağı sonucuna varıldı.