Bir gen modeli olarak nötral lipozomların bivalan metal iyonları ile birlikte kullanımının incelenmesi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü, Biyoteknoloji Anabilim Dalı, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2015
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: FATMA FUNDA DEMİRSOY
Danışman: HİLAL ÖZDAĞ SEVGİLİ
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Gen tedavileri; kalıtsal, otoimmün, immün sistemi baskılayıcı ve kanser hastalıklarının iyileĢtirilmesinde kullanılmak üzere geliĢtirilen yöntemlerdir. Gen tedavisi amacıyla kullanılan viral vektörlerin aktarmak üzere taĢıdıkları DNA‟yı hücreye taĢırken hedefleri dıĢında olan hücreleri de enfekte edebilme, taĢıdıkları DNA‟yı konakçı genomunda entegre olmaması gereken bir bölgeye sokabilme gibi risklerinin bulunması nedeniyle gen tedavisindeki kullanımları sınırlanmaktadır. Gen tedavisinin önündeki bu sınırlamayı kaldırmak üzere hücreye DNA aktarımında plazma membranından geçebilme özelliğine sahip olan lipid vesikülleri denenmektedir. Gen transferi için kullanılan ve lipid veziküllerininin nükleik asitlerle beraber oluĢturduğu nanobileĢenler, genozom veya lipopleks adını almaktadır. Günümüzde insan gen tedavisi ile ilgili araĢtırmalarda alınan sonuçlar yalnızca tedavi edilmesi hedeflenen hücreye özgü gen aktarım araçları bulunmadığından henüz istenen verimde çalıĢmamaktadır. Lipid vesiküllerinin hücrelerin bulunduğu ortama verilmesinden gen ifadesine kadar giden yolda terapötik geni taĢıyan DNA‟yı degradasyondan koruyacak optimize edilmiĢ gen taĢıma sistemlerine ihtiyaç vardır. Yoğun olarak kullanılan katyonik lipitlerle yapılan lipofeksiyon deneyleri sıkça istenmeyen sitotoksisiteye neden olabilmekte, kontrolü zor olan serum stabilitesine olumsuz etki edebilmekte ve tüm bu olumsuzluklar nedeniyle düĢük transfeksiyon oranları ile sonuçlanmaktadır. Bu tez çalıĢmasında sitotoksik katyonik lipozomlar yerine, zwitteriyonik fosfolipitler, çift değerli katyonlar (Mg+2 ve Ca+2) ile DNA bir araya getirilerek toplaĢımlar oluĢturulmuĢ ve bu yapıların özellikleri ile kullanımları irdelenmiĢtir. Daha spesifik olarak çok katmanlı (MLV) ve tek katmanlı (ULV) fosfatidilkolin vezikülleri oluĢturulduktan sonra, çift valanslı metal katyonlarca tetiklenen DNA‟nın MLV ve ULV fosfatidilkolin vezikülleri üzerine adsorpsiyonu, agregasyonu ve adhezyonu UV/VIS spektroskopisi ile araĢtırılmıĢtır. Zwitteriyonik lipozomların termotropik faz değiĢimleri Mg+2 varlığında polinükleotitler ve çeĢitli DNA‟lar ile bileĢik oluĢturmaları termodinamik ölçümler ve floresan mikroskopisi ile incelenmiĢ ve çeĢitli elektrostatik lipit-nükleik asit bileĢiklerinin oluĢumları ile ilgili daha önce yayınlanan verilerle kıyaslanmıĢtır. Bu Ģekilde oluĢan üçlü bileĢiklerin (DNA, lipid, Mg+2) yüzey tanınma ve sınırlararası özellikleri Langmuir-Blodgett tek katman, titreĢim (FTIR ve Raman) spektroskopisi ile araĢtırılmıĢtır. Bu genozomların boyut ve morfoloji analizleri z-potansiyel, Dinamik IĢın Saçılımı (DLS) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Üçlü bileĢiklerin yapısal değiĢikleriyle ilgili termodinamik ve kinetik modellerin ortaya konmasına yönelik olarak Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik (DSC), Termogravimetrik Analiz (TGA) ve Ġzotermal Titrasyon Kalorimetrik (ITC) ölçümleri yapılmıĢtır. Mg+2 varlığında DNA ile lipozomlar arasında meydana gelen füzyon olayları ise floresan ve konfokal mikroskopisi ile incelenmiĢtir. Transfeksiyon için etkili dairesel ve süpersarmallı plazmidlerin oluĢumu agaroz jel elektroforez ile gösterilmiĢtir. Spektroskopik ölçümlerle üçlü bileĢenlerin yapılarında yer alan biyomakromoleküllerin ikincil yapılarındaki yapısal değiĢiklikler gösterilmiĢtir. Mikroskobik ölçümler sonucunda üçlü oluĢumlar görsel olarak tanımlanmıĢ, boyut-potansiyel ölçümleri sonucunda görsel olarak TEM ile belirlenen sonuçlar teyit edilmiĢtir. Termal ölçümler ile biyodinamikleri ve oluĢum termodinamiği parametreleri hesaplanmıĢtır. Ayrıca lipit/DNA/(Mg+2 ve Ca+2) üçlü kompleksinin hücresel sisteme aktarılması için transfeksiyon deneyleri yapılmıĢ; metal katyonlarca (Me+2) gerçekleĢtirilen transfeksiyon etkinlikleri incelenmiĢtir. Bu üçlü toplaĢımın Mg+2 ile yapılan kısmında transfeksiyon gerçekleĢmiĢ ancak deney tekrarlanamamıĢtır. Lipit/DNA/Ca+2 ile transfeksiyon ise başarılı olmuştur.