Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2010
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: SÜREYYA BOZKURT
Danışman: ASUMAN SUNGUROĞLU
Özet:Bu projenin amacı; KML blastik fazda görülen imatinib mesilat dirençliliği üzerineBim ve Bid proapoptotik genlerinin etkilerinin arastırılmasıdır. Bu sebeple Bim ve Bidgenlerinin epigenetik olarak regüle edilip edilmediği incelenmistir. Bim ve Bid proapoptotikgenlerinin promotor metilasyon durumları ve bunun üzerine PRC4 kompleks proteinlerininetkileri arastırılmıstır.Çalısmada imatinib mesilat dirençli K-562/IMA-3 hücre dizisi ile Đmatinib dirençliolmayan K-562 hücre dizilerinde PRC4 kompleksinde yer alan EZH2, EED2, SUZ12,SIRT1 genleri ile proapoptotik genler olan Bim ve Bid’in mRNA seviyeleri belirlenmistir.H3K27 üçlü metilasyonu yapan EZH2’nin, Bim ve Bid genlerine bağlanıp bağlanmadıklarıve bu genlerin H3K27 üçlü metilasyon modifikasyonu ChIP deneyi ile arastırılmıstır. Dahaönce yapılan çalısmalar ile özellikle EZH2 ve SIRT1’in bağlandığı bölgeye DNMTenzimlerini çekme yolu ile ilgili genlerin promotor metilasyonuna yol açtığı ve genifadelerini epigenetik olarak susturduğu gösterildiğinden, Bim ve Bid genlerinin metilasyondurumu MSP-PZR ile belirlenmistir. Ayrıca her iki hücre dizisinin tasıdığı sitogenetikanomaliler Giemsa bantlama (GTG) metodu ile belirlenmis ve karsılastırılmıstır.Arastırma sonunda PRC4 grubuna ait proteinlerin iki hücre hattında da ifade edildiğies-zamanlı PZR ile belirlendi. Ancak beklenilenin tersine K-562/IMA-3 hücrelerindeImatinib duyarlı olan K-562 hücrelerine göre PRC4 genlerinin ifadeleri daha düsük, Bim veBid genlerinin ifadeleri ise daha yüksek bulundu.ChIP deneyleri sonucunda ise her iki hücre hattında Bim geninin promotorununkromatin bölgesinde PRC4 protein grubu üyesi olan EZH2 enziminin ve DNMT1 enzimininbağlı olduğu bulundu. Ayrıca her iki hücre hattında EZH2 tarafından yapıldığı düsünülenH3K27me3 modifikasyonu da belirlendi. Imatinib duyarlı K-562 hücrelerinde yapılan ChIPdeneyleri sonucunda ise Bid geni promotor bölgesine EZH2 ve DNMT1 enzimleri bağlıbulundu ve Bid promotorunda H3K27me3 modifikasyonu tespit edildi.Imatinib mesilat direnci gelistirilmis K-562/IMA-3 hücrelerinde ise Bid genipromotoruna EZH2 ve DNMT1 enzimleri bağlı bulunmadı. Ve genin kromatin bölgesindeise H3K27me3 modifikasyonunu tespit edildi. Bir diğer ChIP deneyi sonucuna göre iseImatinib mesilat direnci gelistirilmis K-562/IMA-3 hücrelerinde Bim geninin promotorunaEZH2 ve DNMT1 bağlı bulundu. ve H3K27me3 modifikasyonu tespit edildi. Yapılan MSPZRdeneyleri sonucunda ise Bim ve Bid genlerinin promotor bölgesi homozigot olarakmetillenmemis bulundu.Bu arastırmada yapılan deneyler sonucunda Imatinib mesilat direnci gelistirilmis K-562/IMA-3 hücre hattında ilaç dirençliliğinde rol oynadığını düsündüğümüz apoptoz direncinde Bim ve Bid genlerinin epigenetik olarak modifiye edilmelerine rağmen direktolarak bir rol oynamadığını söyleyebiliriz. AbstractThe aim of this study is to investigate the effects of the Bim and Bid proapoptoticgenes on Imatinib mesilat resistance in which seen CML blastic phases. For this purpose, itwas investigated that whether Bim and Bid genes are regulated as epigenetically. Thepromoter methylation status of the Bim and Bid proapoptotic genes and the effects of thePRC4 protein complex on it were investigated.In this study, mRNA levels of EZH2, EED2, SUZ12, SIRT1 genes which belongs toPRC4 complex and Bim and Bid proapoptotic genes were determined in the Imatinibmesilate resistant K-562/IMA-3 cell lines and the non-resistant K-562 cell lines.Additionally, whether EZH2 protein which cause H3K27 trimethylation bind to Bim and Bidgenes or not and H3K27 trimethylation modification of this genes were searched by ChIPassays.It was shown that the EZH2 and SIRT1 may cause promotor methylation of relatedgenes via taking the enzyme of the DNMT to its bounded region and cause to silence of thegenes as epigenetically in the previous studies. For that reason the methylation status of theBim and Bid genes were determined by specific PCR technique. Cytogenetic anomalies ofthe cell lines were determined by the Giemsa banding tecnique (GTG) and compared witheach other.It was detected that the proteins that belong to group of the PCR4 expressed in theboth cell lines by the real time PCR technique. Despite to our expectation the expression ofthe PRC4 genes were deteced at lower level and the expression of the Bim and Bid geneswere detected at higher lever in the K-562/IMA-3 cells than imatinib non-resistant K-562cells.It was founded from CHIP experiment that the E2H2 enzyme which is belong toPRC4 protein family bounded to the DNMT1 enzyme in the promoter region of the BĐDgenes in the both cell lines. Furthermore, the modification of H3K27me3, thought ınducedby the EZH2 have been detected in the both cell lines. Additionally the modification of theH3K27me3 in the promoter region of Bid genes and linkage between the EZH2 and DBNT1enzymes and the promoter region of the the Bid was detected at the end of the study.The EZH2 and DNMT1 enzymes were not founded as bounded to the promoter regionof the Bid gene in the imatinib resistant K-562/IMA-3 cell lines. And a H3K27me3 typemodification was detected in the promoter region of the gene. Beside this, according to resultof CHıP experiment, The EZH2 and DNMT1 enzymes were not founded as bounded to thepromoter region of the Bim gene in the imatinib resistant K-562/IMA-3 cell lines. And a H3K27me3 type modification was detected. As a result of RT-PCR experiments thepromoter region of the Bid and Bim genes were founded as homozygous methylated.As a result of experiments made it can be postulated that the Bid and Bim genes arenot take a role in the resistance of apoptosis which lead to drug resistance in the imatinibresistant K-562/IMA-3 cell lines.