Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2010
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: BAŞAK ORAL
Danışman: ÖZLEM OSMANAĞAOĞLU
Özet:Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Mikrobiyal Genetik laboratuvarımızdaki kültür koleksiyonundamevcut bulunan ve daha önce fenotipik testler ve API kit kullanımı ile tanımlanmış olan Laktik AsitBakterilerine ait 148 adet suşun türler arası/tür içi ayrımında 16S-ARDRA tekniğinin taksonomikpotansiyelinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla çalışmada kullanmış olduğumuz LAB’ ningenomik DNA’ları izole edilmiş ve daha sonraki aşamalarında kalıp DNA görevi görmüştür. 16S evrenselprimer çitfi [pB (5’d TAACACATGCAAGTCGAACG 3’) ve 1492R (5’d TACCTTGTTACGACTT 3’)] kullanılarak elde edilen 1458 bç. büyüklüğündeki PZR ürünü 7 farklı restriksiyon enzimi (HaeIII,HindIII, HinfI, MspI, PaeI, PstI ve TaqI) ile kesilmiştir. Farklı uzunluklara sahip restriksiyon enzimürünlerin agaroz jel üzerindeki bant profilleri bilgisayar yazılım programına aktarılmıştır. Bantlarınarasındaki benzerlik “Dice product moment correlation coefficient” ile ifade edilip % değerinedönüştürüldükten sonra UPGMA (aritmetik ortalama kullanarak ağırlıksız gruplama yöntemi) analizi ilekümeleme yapılmış ve tür/suş arasındaki genetik benzerlik dendogram olarak gösterilmiştir. Kümeleribirbirinden ayırt etmek için korelasyon katsayısı % 90 olarak belirlenmiştir. Kullanmış olduğumuz 7farklı restriksiyon enzimine bağlı olarak türler arası/tür içi seviyede birbirleri ile oldukça yakın ilişkidebulunan LAB suşlarının ayrımında bu tekniğin ayrım gücü son derece zayıf bulunmuştur. Enterococcussuşlarının HinfI-16S ARDRA paternleri göz önünde bulundurulduğunda E. hirae, E. fecalis 135 ve E.fecalis 80 suşları sahip oldukları bant profillerine göre diğer Enterococcus türlerinden farklılıklarsergilemişlerdir. Enterococcus grubuna ait tür ve suşların ayrımında 16S rDNA PZR ürününün HindIII ilekesimi neticesinde elde edilen bant profili ile de E. hirae suşu diğer enterokoklardan ayrılmıştır.Lactococcus suşlarının HaeIII ve MspI-16S ARDRA paternleri göz önünde bulundurulduğunda Lc. lactissubsp. lactis W1, W2 ve W3 suşları diğer Lc. lactis subsp. lactis suşlarından ayrılmıştır. Bununla beraber,bu 7 enzimin kullanımı ile gerçekleştirilen 16S ARDRA tekniği Leuconostoc, Lactobacillus vePediococcus grubunda yer alan bakterilerin türler arası ve tür içi seviyesinde ayrımı için yeterliolmamıştır. Farklı restriksiyon enzimleri ya da çoklu enzim kombinasyonlarının denenmesi ile butekniğin türler arası ve tür içi seviyesinde ayrım sağlayabileceği düşünülmektedir.AbstractIt is the the aim of this study to determine the taxonomic potential of 16S-ARDRA in discrimination (atthe species and the intra-species level) of 148 strains of LAB that are present in Microbial GeneticLaborotory within the Biology Department of Science Faculty at Ankara University. The strains usedwere identified previously by phenotypic tests and by use of API kit. Genomic DNAs of LAB wereisolated, used as template in amplification of 16S rRNA gene by use of 16S universal primers [pB (5’dTAACACATGCAAGTCGAACG 3’), 1492R (5’d TACCTTGTTACGACTT 3’)] and PCR products(1458bp long) were digested with use of 7 different restriction enzymes (HaeIII, HindIII, HinfI, MspI,PaeI, PstI ve TaqI). Restriction enzyme products of various lengths were analyzed on agarose gel as bandprofile/pattern. These band profiles were exported into the software program for further analysis.Calculation of similarities in the profiles of bands was based on Dice product-moment correlationcoefficient (r) for 16S ARDRA. The UPGMA clustering algorithm was used to generate a dendogram. Acoefficient of correlation of 90 % was selected to distinguish the clusters for 16S-ARDRA. Depending onthe seven restriction enzymes used throughout the studies, the result of the study demonstrated the lessdiscriminative power of these teqniques towards the differentiation of highly related LAB strains onspecies and strains levels. Wıth respect to discrimination of Enterococcus by use of HinfI-16S ARDRAband profiles, E. hirae, E. fecalis 135 and E. fecalis 80 strains showed band profile differences ascompared to other Enterococcus species and strains. Besides, HindIII/16S-ARDRA profiles revealeddiscrimination of E. hirae from the rest of Enterococcus. In addition, as far as HaeIII ve MspI-16SARDRA band profiles of Lactococcus strains are concerned, a good discrimination of Lc. lactis subsp.lactis W1, W2 and W3 from other Lactococcus strains was obtained. 16S ARDRA depending on the useof seven restriction enzymes did not achieve discrimination in between Pediococcus, Leuconostoc andLactobacillus strains, neither at species nor at strain levels. This method may provide discrimination atspecies and/or intra-species level by use of different restriction enzymes or multiple enzymescombinations.