Hücre kültürü pasajlarının PPR virus P geni düzeyinde etkisinin araştırılması ve tanısal amaçlı gerçek zamanlı reverz transkritaz polimeraz zincir reaksiyonu (rtRT ? PCR) protokollerinin geliştirilmesi

---

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Biyoteknoloji Enstitüsü, Biyoteknoloji Anabilim Dalı, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2010

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: ENDER DİNÇER

Danışman: AYKUT ÖZKUL

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Peste Des Petits Ruminants (PPR), paramyxoviridae ailesinde, morbillivirus alt grubunda yer alan, hayvansal gıda üretiminin önemli bir bileşeni olan küçük ruminantların Asya ve Afrika` da artan öneme sahip, yüksek enfeksiyöz ve bulaşıcı karekterde hızlı yayılım gösteren önemli viral bir hastalığıdır. Hastalık çoğu gelişmekte olan Asya ve Afrika ülkelerinde endemiktir ve % 90'a varan mortalite oranı ile seyreden salgınlar oluşturmaktadır. Etkenin teşhisine yönelik farklı serolojik ve moleküler teknikler zaman içinde önemli ilerlemeler kaydetmiştir. Etkenin en kısa zamanda ve en yüksek doğrulukta ortaya konması için geliştirilen en önemli tekniklerden biri `gerçek zamanlı' PCR sistemidir.Çalışmamızda kullanılan primer ve prob tasarımları tamamen 2001 yılında Türkiye'de izole edilen ve genom sekansı gen bankasına girilen PPRV/TU00 izolatı üzerinden yapıldı. PPRV'e ait olan N, P, L ve M gen bölgelerine spesifik primer ? prob tasarımlarını kullanarak tek adımda viral RNA'nın kantitatif olarak tesbitinin gerçekleştirilmesi amaçlandı. Buna yönelik olarak, anabilim dalımıza farklı zamanlarda ulaşan ve konvansiyonel RT-PCR testi ile pozitif bulunmuş olan 45 adet koyun ve keçiye ait kan, serum ve organ numuneleri kullanıldı. PPRV RNA'sının kantitasyonu için in vitro transkripsiyon ve enfektif partikül sayısı bilinen virus sulandırmaları kullanıldı. Plasmidlerden cRNA eldesi sırasında yaşanan sorundan dolayı titresi bilinen virus RNA `sının bilinen miktarda oluşturulan örneklerin döngü eşik değerlerine karşılık başlangıçtaki kopyalarının logaritmik konsatrasyonlarının olduğu standart doğrular oluşturuldu. Yapılan denemelerde L gen bölgesine spesifik primer ? prob dizaynları ile L geni için 1,65 × 101, P geni için 5,88 , M geni için 1,01× 101 ve N geni için 1,73 × 103 kopya/ml`ye kadar saptanabildiği gözlendi.Bununla beraber hastalığın çok ciddi sıkıntılar oluşturması uygun, etkin, sorunsuz aşı geliştirilmesine yönelik çalışmaların artmasına yol açmıştır. Çalışmamızın ikinci ayağı olarak virusun hücre kültürlerinde pasajlanması sonucu PCR ile çoğaltmış olduğumuz P geninde meydana gelen değişimlerin dizin analizi metodu yardımıyla incelenmesi ve tesbiti gerçekleştirildi. Ancak dizinler arasında değişimler gözlenmedi ve dizinlerin stabil oldukları tesbit edildi.