Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2011
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: NEFİSE AKKOÇ
Danışman: MUSTAFA AKÇELİK
Özet:MisL ototransporter proteininin in vitro koşullarda üretimi, MarT regülatör proteini yapısal geninin pBADgIII/a vektörüne klonlanması ve doğal Salmonella Typhimurium LT2 suşuna aktarımı yolu ile gerçekleştirildi. Bu transformantta optimum MisL proteini üretiminin gelişme ortamına % 0.02 L-arabinoz ilavesi sonucu gerçekleştiği, β-galaktozidaz testi (560 Miller ünitesi) ve western lekeleme yöntemi kullanılarak belirlendi. İn vitro koşullarda MisL üretimi gerçekleştiren S. Typhimurium LT2 mutantında yürütülen immüno elektron mikroskopi çalışmaları, bu proteinin hücre yüzeyine salgılandığını ve ekzopolisakkaritlerle ilişkilenerek hücrenin en dışında düzensiz bir tabaka oluşturduğunu gösterdi. MisL geninin pozitif regülatörü olan MarT proteininin ifade edildiği mutantın, doğal suş ile karşılaştırılarak yorumlanan mikrodizin analizleri, bu regülatörün; dps, yliH, wraB, flgK, osmE, manZ, cheM, cheA, motB, fliA; fliC genlerini negatif yönde, aceE, aceFi lpdA, tsf, allC, cydB, wzzB, rplP, rpsC, rplW, rplD, rplC, rmbA, misL, fidL, marT, slsA ve cpxP genlerini ise pozitif yönde regüle ettiği kanıtlandı. İn vitro koşullarda yürütülen bağlanma ve birlikte çöktürme denemeleri sonucunda ise, MisL proteininin fibronektinin heparin-II domainine (hep-II) özgül bir şekilde bağlandığı saptandı.Abstract In vitro production of MisL autotransporter protein was performed by clonning functional gene of the MarT regulator protein to pBADgIII/a vector, which was then used to transform wild type Salmonella Typhimurium LT2 strain. The optimum MisL protein production of this transformant was obtained with addition of 0.02 % L-arabinose to the growth medium, monitored by a β-galactosidase test (560 Miller units) and western blotting analysis. Immunoelectron microscopy experiments, performed with S. Typhimurium LT2 mutants which produce the MisL protein under invitro conditions, showed MisL to be secreted at the bacterial cell surface and forming an irregular layer complexed with exopolysaccarides. Comparative microarray experiments between wild type and mutant strains expressing the marT protein, which is the positive regulator of misL gene, showed that the expression of marT downregulated the dps, yliH, wraB, flgK, osmE, manZ, cheM, cheA, motB, fliA; fliC genes and upregulated the aceE, aceFi lpdA, tsf, allC, cydB, wzzB, rplP, rpsC, rplW, rplD, rplC, rmbA, misL, fidL, marT, slsA and cpxP genes. Results of in vitro adhesion and pull-down experiments showed that there was a specific binding interaction between MisL protein and the Hep-II domain of fibronectin.