Fare spermatogonyal kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 ile hedefli genom düzenleme
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, GENETİK ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2020
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: SÜHEYLA YEŞİLBOSTAN
Danışman: BENGİ ÇINAR KUL
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:CRISPR-Cas9 rehber DNA endonükleaz teknolojisi, çeşitli hücre tipleri ve organizmalarda biyolojik süreçlerin incelenmesi için, hedeflenmiş genomik mutasyonların üretilmesinde yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Yapılan çalışmalarda CRISPR/Cas9'un SKH'lere uygulanmaları, spermatogenez ve spermatogenetik başarısızlığın genetik mekanizmasının ortaya çıkarılmasında etkili birer yöntem olduklarını göstermiştir. Testis-expressed 15 (Tex15) genindeki fonksiyon kaybı erkeklerde infertilite ile ilişkilendirilmiştir. Sunulan çalışmada, spermatogonyal kök hücre kültür hattında CRISPR-Cas9 yöntemiyle lentiviral plasmid vektörün transfeksiyonu sonrası Tex15 geninin susturulmasına yönelik deneyler gerçekleştirilmiştir. Çalışmada; Tex15 geninin 1.ekzonunu 3 farklı bölgeden hedefleyen CRISPR-Cas9 uygulama grubu, CRISPR-Cas9 kimyasallarının kontrolü amacıyla, herhangi bir gene komplementer olmayan sgRNA klonlanmış vektörün aktarıldığı sham grubu ve sadece pasajlama yapılan kontrol grubu olmak üzere üç grup tasarlanmıştır. Deney aşamasında; spermatogonyal kök hücrelere invitro ortamda farklı DNA: DNAfectin oranlarında lipit temelli aktarım ile CRISPR-Cas9 uygulaması gerçekleştirilip, Tex15 geninde c.959C2den itibaren çerçeve kaymasına neden olan indel mutasyonlar elde edilmiştir. Başarının etkinliği mutasyon bölgesi enzim kesim analizi, DNA dizi analizi ve in-silico analizler ile ortaya konulmuştur. En yüksek transfeksiyon etkinliği in-silico analizde 1:5 DNA:DNAfectin oranı için % 98 olarak hesaplanmış ve bu oranın SKH'ler için en uygun oran olduğu tespit edilmiştir. Sunulan çalışma ile CRISPR/Cas9 uygulamasının SKH'lerde farklı genlerde de yapılabilmesi ve dolayısıyla SKH aracılı genom düzenleme ile transgenik hayvan oluşturma, çiftlik hayvanlarında verimi artırma ve hayvan hastalıklarının tedavisinde kullanılma potansiyeli olan gen/genom düzenleme çalışmaları için literatüre katkı sağlanmıştır.