Mezenkimal kök hücrelerin ın vitro ortamda çoğaltılması ve farklılaştırılması sırasında standart referans genlerin stabilitesinin belirlenmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, KÖK HÜCRE VE YENİLEYİCİ TIP ANABİLİM DALI (DİSİPLİNLERARASI), Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2018
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: FATMA BETÜL AYANOĞLU
Danışman: AYŞE ESER ELÇİN
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Mezenkimal kök hücreler (MKH), yenileyici tıp uygulamalarında yaygın olarak kullanılan hücre kaynaklarındandır. Günümüzde çeşitli kaynaklardan elde edilen MKH'ler, klinik öncesi ve klinik çalışmalarda kullanılmaktadır. Hastalıkların tedavisinde kullanılmak üzere uygun MKH kaynağının seçilebilmesi için, MKH'lerin in vitro şartlarda kendini yenileme, çoğalma ve farklılaşma özelliklerinin kantitatif olarak değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu amaçla MKH'lerin gen ekspresyonlarının belirlenmesinde kantitatif eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) yöntemi kullanılmaktadır. qRT-PCR yöntemi ile doğru ve güvenilir sonuçlar elde edilebilmesi için gen ekspresyon seviyelerinin housekeeping/referans genler kullanılarak normalize edilmesi gerekmektedir. Bu nedenle normalizasyon için uygun housekeeping/referans genlerin seçilmesi oldukça önemlidir. MKH çalışmalarında uygun ve güvenilir olan housekeeping/referans genlerin belirlenmesi ve seçimi ile ilgili literatürde sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmaların büyük bir kısmı KİMKH'ler kullanılarak gerçekleştirilmiş, çok küçük bir kısmında ADMKH'ler araştırılmıştır. Yapılan bu çalışmalar sonucunda MKH'lerin kültür ortamında çoğaltılması ve farklılaştırılması deneyleri için ortak bir housekeeping/referans gene rastlanmamıştır. Bu tez çalışmasında insan ADMKH'lerin in vitro kültür ortamında çoğalması, osteojenik, adipojenik ve kondrojenik farklılaşması sırasında yaygın olarak kullanılan housekeeping/referans genlerin ekspresyon kararlılığının incelenmesi ve insan ADMKH araştırmaları için uygun olan housekeeping/referans genlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla MKH araştırmalarında yaygın olarak kullanılan 13 housekeeping/referans gen seçilmiştir. Tez çalışmasında öncelikle insan ADMKH'leri in vitro kültür ortamında çoğaltıldı. ADMKH'lerin karakterizasyonu üçlü soy farklılaşması, akım sitometri ve CFU analizleri ile doğrulandı. Çoğaltılan hücreler standart farklılaşma protokolleri kullanılarak osteojenik, adipojenik ve kondrojenik hücre soylarına farklılaştırıldı. İnsan ADMKH'lerin farklılaşması histokimya boyamaları ve ışık mikroskobu görüntüleri ile kontrol edildi. Farklılaşmanın sonunda toplanan hücrelerden mRNA izolasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen mRNA örnekleri cDNA'ya çevrilerek housekeeping/referans genlerin ekspresyon seviyeleri qRT-PCR yöntemi ile belirlendi. Housekeeping/referans genlerin ekspresyon kararlılıkları karşılaştırmalı delta Ct yöntemi ve NormFinder analizi kullanılarak değerlendirildi. Tez çalışmasının sonucunda EF1α, RPLP0 ve RPL13A genlerinin ekspresyon kararlılıklarının yüksek olduğu görülmüş ve insan ADMKH araştırmalarında normalizasyon için housekeeping/referans gen olarak kullanılabilecekleri öngörülmüştür. GAPDH geni ise en düşük kararlılığa sahip gen olarak tanımlanmış ve ADMKH'lerin üçlü soya farklılaşması çalışmaları için uygun bir housekeeping/referans gen olmadığı sonucuna ulaşılmıştır. Elde edilen bu bilgiler ADMKH çalışmalarında uygun housekeeping/referans genlerin seçilmesi ve gen ekspresyonlarının doğru bir şekilde ölçülebilmesi için son derece önemlidir.