Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2006
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: MEHMET BAKKAL
Danışman: ZEKİYE SERPİL TAKAÇ
Özet:(S)-Naproksenin tutuklanmış Candida rugosa lipazı (CRL) biyokatalizörlüğünde rasemik naproksen metil ester karışımından enantiyoseçimli hidroliz tepkimesi ile ayırılmasında, tutuklama ve tepkime koşullarının enzim aktivitesi ve enantiyoseçimliliği üzerine etkileri incelenmiştir. CRL'nin tutuklanma koşulları, enzim miktarı, sulu faz/organik çözücü hacim oranı, sıcaklık, pH, substrat derişimi ve destek türü tutuklanmış enzimin aktivite ve enantiyoseçimliliğini etkilemiştir. CRL; Amberlite XAD-7, Montmorillonit K10 ve işlem görmüş kile tutuklanmıştır. Enzimin Amberlite XAD-7'ye tutuklanması üç saat sonunda tamamlanmış; ancak tutuklanan enzimlerde destekten sızma %10'un üzerinde olmuştur. Tutuklama süresi altı saate çıkarıldığında destekten sızma %2'nin altına düşmüştür. Tutuklanmış enzim biyokatalizörlüğünde enantiyoseçimli hidroliz tepkimeleri organik faz (izooktan)- tampon iki fazlı sistemde izoterm koşullarda çalkalamalı hava banyosunda gerçekleştirilmiştir. Tutuklama ve hidroliz tepkimesinin sıcaklık ve pH'ları aynı olduğu zaman tutuklanmış enzim daha iyi katalitik aktivite göstermiştir. Sıcaklık 37oC'den 45oC'ye yükseldikçe dönüşüm artmış, ürünün enantiyomerik aşırılığı değişmemiştir. 50oC'de ise tutuklanmış enzimin aktivitesi ve rasemik naproksen metil esterin hidroliz tepkimesindeki dönüşümü azalmıştır. 45oC ve pH=7.5'da 120 st sonunda dönüşüm x= %43.3 ve enantiyomerik oran E=97.3 iken; 50oC ve pH=7.5'da x=%24.5 ve E = 42.6'dır. 45oC ve pH=4'de 1 g XAD-7 üzerine 800 mg ham enzim kullanılarak proteinin %95'i tutuklanmış ve 120 saat sonunda x=%45 ve E=87.7 olmuştur. En iyi değerler 45oC ve pH=6'da 120 saat sonunda x=%47.6 ve E=176 olarak elde edilmiştir. pH=9'da ise enantiyoseçimli hidroliz tepkimesi gerçekleşmemiş ve 120 st sonunda dönüşüm %5'de kalmıştır. Sulu faz/organik faz hacim oranı=1/4'de hidroliz tepkimesi daha hızlı gerçekleşmektedir. Tamponla doyurulmuş organik fazda ise ilk 24 st sonunda en hızlı hidroliz tepkimesi gerçekleşmiş; sonrasında tepkime hızı azalmıştır. Substrat derişiminin etkisi 45oC ve pH=6'da 5, 10, 12.5 ve 15 mg/ml değerlerinde incelenmiş ve 120 st sonunda en yüksek dönüşüme 10 mg/ml substrat derişiminde ulaşılmıştır. 45oC ve pH=6'da Amberlite XAD-7'ye tutuklanmış olan enzimin tekrar kullanımı incelenmiş ve 180 st sonunda birinci kullanımda x=%48.7 ve E=172.4; ikinci kullanımda x=%46.1 ve E=125; üçüncü kullanımda x=%40.3 ve E=95 ve dördüncü kullanımda 120 saat sonunda x=%27 ve E=63.6'ya ulaşılmıştır. Montmorillonit K10'a tutuklanmış enzim ile 45oC ve pH=6'da 120 st sonunda %22.4 dönüşümle E=18.9'a ulaşılmıştır. İşlem görmüş kile tutuklanmış enzim ile 45oC ve pH=3'de 120 st sonunda %30 dönüşümle E=250'ye ulaşılmıştır. Geri döngülü dolgulu kolon biyoreaktörde, Amberlite XAD-7'ye tutuklanmış enzimle rasemik naproksen metil esterin dinamik kinetik rezolüsyonunda 24.st sonunda %43.8 dönüşümle enantiyomerik aşırılık değeri % 97.05 olan (S)- naproksen üretilmiştir. Abstract The effects of immobilization and reaction conditions on the enzyme activity and enantioselectivity in the production of (S)-naproxen through the enantioselective hydrolysis of racemic naproxen methyl ester by the catalytic effect of immobilized Candida rugosa lipase (CRL) were investigated. Immobilization conditions, enzyme loading, aqueous/organic phase volume ratio, temparature, pH, substrate concentration and the type of immobilization material affected the enzyme activity and enantioselectivity. CRLon the Amberlite XAD-7 was immobilized on the Amberlite XAD-7, Montmorillonite K10 and treated clay. Immobilization of CRL was completed after three hour, however, more than 10% leakage was observed. When the immobilization period increased to six hours, the leakage decreased to 2%. The enantioselective hydrolysis reactions in the presence of immobilized enzymes were carried out in an organic solvent (isooctane) - aqueous (buffer solution) biphasic system in an orbital shaker under isothermal conditions. Better catalytic activity was obtained when the same temperature and pH were employed both in the immobilization and hydrolysis reaction. The increase in temperature from 37 oC to 45 oC increased the conversion; however, the enantiomeric excesses of the product did not change. The activity of the enzyme and the conversion in the hydrolysis of racemic naproxen methyl ester decreased at 50oC. The conversion of x= 43.3% and the enantiomeric ratio of E=97.3 were achieved at 45oC and pH=7.5 at the residence time of 120 h, where x=24.5% and E = 42.6 were obtained at 50 oC and pH=7.5. 95% of protein was immobilized when 800 mg crude enzyme/g Amberlite XAD-7 was used in the immobilization performed at 45 oC and pH=4; and x=45% and E=87.7 were obtained at 120 h. The best results were obtained as x=47.6% and E=176 in the hydrolysis reaction carried out at 45oC and pH=6 for 120 h. On the other hand, enantioselective hydrolysis reaction rate was low at pH=9 and only 5% of conversion at the residence time of 120 h could be obtained. Higher hydrolysis rate were obtained when the aqueous/organic phase volume ratio was 1/4 in comparison with the buffer-saturated organic phase. However the highest initial reaction rate was obtained in buffer-saturated organic phase which decreased after 24h. The effect of substrate concentration was investigated for 5, 10, 12.5 and 15 mg/ml values at 45oC ve pH=6; and the highest conversion was obtained at 10 mg/ml after 120h. Reutilization of immobilized CRL on Amberlite XAD-7 was investigated with four successive hydrolyses where x=48.7% and E=172.4; x=46.1% and E=125; x=40.3% and E=95 were obtained after first three 180 h reactions; and x=27% and E=63.6 were obtained after the last 120 h batch. Only 22.4% conversion and 18.9 enantiomeric ratio were obtained with the immobilized CRL on Montmorillonite K10 at 45oC and pH=6 after 120 h. When the immobilized CRL on treated clay was used in the hydrolysis at 45oC and pH=3 for 120 h, x=30% and E=250 were obtained. In the dynamic kinetic resolution of racemic naproxen methyl ester with the immobilized CRL on Amberlite XAD-7, (S)-naproxen was obtained with 43.8% conversion and enantiomeric ratio of 97.05 at the residence time of 24 h