Akademik Veri Yönetim Sistemi
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2015
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: Elfinesh Shikur GEBREMARIAM
Danışman: AZİZ KARAKAYA
Özet:Buğday (Triticum spp.) insan beslenmesinde önemli bir role sahip olup dünya nüfusunun % 40’ı için temel besindir (Bockus vd. 2010). Türkiye’de buğday beslenmedeki protein ve kalorilerin yarısından fazlasını sağlamaktadır (Hanson vd. 1982). Türkiye buğday üretiminde dünyada onuncu sırada olup 2013 yılında 7.77 ha alanda 22.1 milyon ton buğday üretimi gerçekleştirilmiştir (Anonymous 2014). Türkiye’de ortalama buğday verimi hektara 2.8 tondur (Anonymous 2014). Buğday bitkisinde görülen kök boğazı hastalıklarından dolayı %30’dan fazla ürün kaybı rapor edilmiştir (Cook 1968, 1992, Mishra 1973, Klein vd. 1991, Burgess vd. 2001, Hekimhan vd. 2004). Türkiye’de yetiştirilen ekmeklik buğdaylarda kökboğazı çürüklükleri tarafından %24 ile %43 arasında değişen oranlarda ürün kayıpları rapor edilmiştir (Nicol vd. 2001, Hekimhan vd. 2004). Her ne kadar Türkiye’de buğdaylarda kök boğazı çürüklüğü ile ilgili olarak bazı çalışmalar yapılmış olsa da bunların çoğunluğu belli coğrafik alanlarda yapılmış olup 5 yıldan daha eski tarihlerde yapılmış çalışmalardır (Aktaş vd. 1996, Mamluk vd. 1997, Aktaş vd. 1999, Aktaş vd. 2000, Demirci ve Dane 2003, Bentley vd. 2006a, Akgül ve Erkılıç 2007, Tunali vd. 2008, Arıcı ve Koç, 2010). Bu çalışmada Türkiye’nin ekolojik olarak değişik ziraiiiibölgelerinde kök boğazı çürüklüğü belirtileri gösteren buğday bitkileri ile ilişkili Fusarium türleri ve patojenisiteleri ortaya konulmuştur. Ek olarak, tanımlanan en virulent Fusarium culmorum izolatına karşı bazı buğday hatlarının dayanıklılık durumları ortaya konulmuştur. Türkiye’nin buğday yetiştirilen ana bölgelerinden surveyler yapılarak hastalıklı buğday örnekleri toplanmıştır. 2013 yılının Mayıs, Haziran ve Temmuz aylarında buğday örnekleri Ege, Akdeniz, Karadeniz, Orta Anadolu, Güneydoğu Anadolu ve Doğu Anadolu bölgelerinden toplanmıştır. Örnekler 200 tarladan toplanmış ve funguslar belirti gösteren kök boğazı dokularından izole edilmişlerdir. İzolasyonları antibiyotik katılmış (100’er mg/l ampisilin ve streptomisin sülfat) Peptone PCNB ortamı (15 g peptone, 1 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4.7H2O, 0.75 g PCNB, and 20 g agar per 1 l distilled H2O,) (Nash ve Synder 1962, Booth 1971, Burgess vd. 1994, Leslie ve Summerell 2006) kullanılarak yapılmış ve kültürler 5-7 gün 25oC gündüz/20oC gecesıcaklıklarında 12 saatlik fotoperiyot altında geliştirilmişlerdir. Peptone PCNB agardan elde edilen kültürler spor gelişmesini sağlamak üzere SNA ortamına (1 g KH2PO4, 1 g KNO3, 0.5 g MgSO4.7H2O, 0.5 g KCL, 0.2 g glukoz, 0.2 g sukroz, 20 g agar, bir litre distile su) aktarılmışlar ve 7-10 gün yukarıda belirtilen inkubasyon şartlarında muhafaza edilmişlerdir (Burgess vd. 1994, Leslie ve Summerell 2006). SNA ortamında geliştirilen fungusun steril saf su içinde konidi süspansiyonu hazırlanmıştır. Spor süspansiyonu su agarına (20 g agar, 1 l saf H2O) (Burgess vd. 1994, Leslie ve Summerell 2006) dökülmüş ve fazla su ortamdan uzaklaştırılmıştır. Su agarı ve konidiler içeren Petri kutuları 30-40 derecelik açıda karanlıkta 25oC de 18-20 saat tutulmuşlardır. Su agarında çimlenen tek konidiler alınarak SNA ortamına aktarılmıştır. Monosporik Fusarium kültürleri %15’ lik gliserolde -80 ºC de tutulmuşlardır. Fusarium izolatları morfolojik ve moleküler yöntemler kullanılarak tür düzeyinde teşhis edilmişlerdir. Fusarium türlerinin morfolojik teşhis çalışmalarında makro- ve mikro konidilerin morfolojisi, fiyalid yapısı, miselyum yapıları, agarda oluşturulan pigmentler ve büyüme hızı değerlendirilmiş ve teşhis anahtarları kullanılmıştır (Booth 1971, 1977, Burgess vd. 1994, Summerell vd. 2003, Leslie ve Summerell 2006). Moleküler teşhisivçalışmaları için Patates Dekstroz Broth sıvı kültüründe 7 gün yetiştirilen fungus miselyumundan FastDNA kiti kullanılarak üretici firmanın tavsiyelerine gore fungal DNA ekstrakte edilmiştir (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA). Fusarium izolatları translation elongation factor-1 alpha (TEF-1α) gen bölgesi ef1 (5’-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3’) ve ef2 (5’-GGARGTACCAGTSATCATG-3’) primerleri (O’Donell vd. 1998) kullanılarak standart bir PCR prosedürü ve 53oC bağlanma sıcaklığı kullanılarak çoğaltılmıştır (Geiser vd. 2004). TEF1–α gene sekansları manuel olarak ChromasLite software V.2.1 (Technelysium Pty Ltd, South Brisbane, Australia) kullanılarak gözden geçirilmiştir. Kontrol edilen diziler (yaklaşık 650 bp) daha sonra NCBI BLAST programı veritabanındaki Fusarium türlerinin referans dizileri ile karşılaştırılmış (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) ve Fusarium türleri belirlenmiştir. Fusarium türleri teşhis edildikten sonra 17 Fusarium türünü temsil eden 342 izolat agar disk yöntemi ile hassas makarnalık buğday çeşidi Kızıltan-91 kullanılarak patojenisite testleri yapılmıştır. Inokulasyondan sonra bitkiler 16 saat ışık, 25/15 (+5) oC gündüz/gece sıcaklığı ve % 60/80 (+10) nisbi nem içeren büyütme odasında muhafaza edilmiştir (Mitter vd. 2006). Bitkiler gerektikçe sulanmıştır. Deneme sonuçları teyit etmek için tekrarlanmıştır. İnokulasyondan 9 hafta sonra bitkilerin toprakları yıkanmış ve yaprak kını kısımları çıkarılmıştır. Hastalık Wildermuth ve McNamara (1994) ıskalasının değiştirilmiş şekli (Nicol vd. 2001) kullanılarak kökboğazı ve ana kök üzerindeki kahverengileşmeler göz önüne alınarak değerlendirilmiştir (1-5 ıskalası: 1: % 1-9, 2: % 10-29, 3: % 30-69, 4: % 70-89, 5: %90-99). Patojenisite testini müteakip 46 F. culmorum izolatı genotip tarama testlerinde kullanılacak en virulent izolatı tespit etmek için hassas makarnalık buğday çeşidi Kızıltan-91 kullanılarak kök boğazı inokulasyon yöntemi kullanılarak test edilmişlerdir. Bu çalışmada 1x106 spor/ml spor yoğunluğu kullanılmıştır. Kontrol uygulamalarında aynı miktarda steril saf su kullanılmıştır. İnokulasyondan sonra bitkiler plastik örtü ile kaplanarak 24 saat yüksek nemde ve karanlıkta yukarıda açıklanan iklim odasıvşartlarında tutulmuşlardır. Hastalık şiddetinin değerlendirilmesi inokulasyondan 21 gün sonra yukarıda açıklanan 1-5 ıskalasına göre yapılmıştır. En virulent Fusarium culmorum izolatı olan Fc2 izolat 165 yazlık buğday genotipinin tepkilerini test etmek için kullanılmıştır. Ekimden 1 hafta sonra (tohumları çimlendirmeden 10-11 gün sonra) 165 yazlık buğday hattı 1x106spor içeren ve % 0.1 v/v Tween 20 eklenmiş 1 ml spor süspansiyonu kök boğazına (toprak seviyesinden yaklaşık 0.5 cm yukarıya) steril bir pipet yardımı ile inokule edilmiştir (Mitter vd. 2006). Kontrol çeşitleri aynı miktar spor yoğunluğu kullanılarak inokule edilmiştir. Deneme 5 tekerrürlü olarak kurulmuştur. Uygulamalar tesadüf blokları deneme desenine göre gerçekleştirilmiş ve bitkiler yüksek nem sağlanması amacı ile 48 saat yüksek nemde ve karanlıkta tutulmuşlardır (Mitter vd. 2006). Bitkiler daha sonra yukarıda belirtilen şartlarda iklim odasında muhafaza edilmişler ve gerektikçe sulanmışlardır. Deneme sonuçların teyit edimesi amacı ile tekrar edilmiştir. İnokulasyondan 9 hafta sonra yukarıda açıklanan 1-5 ıskalası kullanılarak hastalık değerlendirmeleri yapılmıştır. Bu çalışmada elde edilen 342 izolattan 17 değişik Fusarium türü tanımlanmıştır. Bu türler F. culmorum, F. pseudograminearum, F. graminearum, F. equiseti, F. acuminatum, F. brachygibbosum, F. hostae, F. redolens, F. avenaceum, F. oxysporum, F. torulosum, F. proliferatum, F. flocciferum, F. solani, F. incarnatum, F. tricinctum ve F. reticulatum’dur. Fusarium equiseti en yaygın izole edilen tür olmuş ve izole edilen Fusarium türlerinin %35.55’unu oluşturmuştur. Patojen türler arasında F. culmorum survey yapılan tarlaların %13.29’undan izole edilmiş ve en yaygın tür olarak bulunurken F. pseudograminearum ve F. graminearum survey yapılan tarlaların yalnızca %0.87 ve % 0.29’undan izole edilmişlerdir. Patojenisite testi yapılan 17 Fusarium türünden altısı değişik oranlarda hastalık oluşturmuştur. Fusarium culmorum, F. pseudograminearum ve F. graminearummakarnalık buğday çeşidi Kızıltan-91’deyüksek derecede hastalık oluşturmuştur. Fusarium avenaceum ve F. hostae orta derecede patojen olarakvibulunmuştur. Fusarium redolens zayıf patojen olarak bulunmuştur. Fusarium acuminatum’ un bazı izolatları zayıf patojen olarak bulunmuştur. Fusarium oxysporum, F. equiseti, F. solani, F. incarnatum, F. reticulatum, F. flocciferum, F. tricinctum, F. brachygibbosum, F. torulosum ve F. proliferatum türleri ise patojen olarak bulunmamışlardır. Hassas makarnalık buğday çeşidi Kızıltan-91 kullanılarak yapılan virülenslık çalışmalarında Fusarium culmorum izolatlarının virülenslık bakımından farklılıklar gösterdiği bulunmuştur. Hastalık şiddeti skorları 1.2-4.4 arasında değişmiş olup ortalama 3.0 olmuştur. İzmir’den elde edilen Fusarium culmorum izolatı (Fc2) en virulent izolat olarak bulunmuştur (ortalama skor 4.4). Test edilen 165 hat içinde iki hat (147 ve 158) dayanıklı reaksiyon göstermiş olup 1.4 skor değeri almışlardır. 20 hat (5, 100, 143, 163, 32, 138, 86, 89, 104, 123,153, 161, 8, 34, 142, 9, 15, 47, 116, 146) orta derecede dayanıklı reaksiyon göstermiş olup 1.6 ile 2.4 arasında değişen skor değerleri almışlardır. Dayanıklı ve orta derecede dayanıklı reaksiyon gösteren hatlar orta derecede dayanıklı kontrol çeşitleri Suntop (1.6), Carisma (1.8) ve Altay-2000 (2.4) çeşitlerinden önemli derecede farklılık göstermemişlerdir. Hatların % 63’ü orta derecede hassas reaksiyon vermiştir. Orta derecede hassas reaksiyon gösteren hatların skor değerleri 2.6 ile 3.4 arasında değişmiş olup orta derecede hassas kontrol çeşitleri Adana-99 (ıskala değeri: 2.6), Janz (ıskala değeri: 2.6) ve Emu Rock (ıskala değeri: 2.6) çeşitlerinden önemli derecede farklılık göstermemişlerdir. Test edilen 165 hattan 39 tanesi hassas reaksiyon vermişlerdir. Hassas reaksiyon gösteren hatların skor değerleri 3.6 ile 4.4 arasında değişmiş olup hassas kontrol çeşitleri Süzen-97 (ıskala değeri: 3.6) ve Kutluk-94 (ıskala değeri: 4.0) çeşitlerinden önemli derecede farklılık göstermemişlerdir. Türkiye’nin önemli buğday yetiştiriciliği yapılan bölgelerinde kök boğazı çürüklüğü ile ilişkili Fusarium türlerinin çok sayıda olduğu ve türlerin bölgelere gore dağılımında farklılıkların olduğu ortaya konulmuştur. Fusarium equiseti Türkiye’de survey yapılan bölgelerde en yaygın tür olarak bulunmuştur. Patojen Fusarium türleri arasında F.viiculmorum buğday yetiştirilen bölgelerin çoğunda göreceli olarak yüksek oranlarda bulunmuştur. Makarnalık buğday çeşidi Kızıltan-91 ile yapılan fide dönemi patojenisite çalışmalarında Fusarium culmorum, F. graminearum ve F. pseudograminearum’un en önemli patojen türler olduğu görülmüştür. Fusarium graminearum ve F. pseudograminearum çok düşük oranlarda bulunmuş olup Türkiye’de buğday üretimini sınırlamayacağı düşünülmektedir. Bu çalışmada bir çok diğer Fusarium türleri de izole edilmiştir. Bunların kök boğazı patojeni olarak önemlerinin sınırlı olduğu düşünülmektedir. Test edilen buğday hatlarının %13’ü dayanıklı/orta derecede dayanıklı reaksiyon vermiştir. Bu hatlar Fusarium kök çürüklüğü hastalığına karşı ıslah çalışmalarında dayanıklılık kaynağı olarak kullanılabilir. Türkiye’de buğday bitkisinde kök boğazı çürüklüğü hastalığına dayanıklılık çalışmalarında Fusarium culmorum gözönüne alınmalıdır. Fusarium culmorum patojeninin yaygın olduğu alanlarda en az 2 yıllık tahıl olmayan bitkilerle münavebe, hastalığa belli ölçüde dayanıklılık gösteren buğday çeşitlerinin ekilmesi, uygun azot gübreleme ve sulama programlarının oluşturulması gerekmektedir.AbstractThis research was carried out with the aim of studying the diversity and pathogenicity of Fusarium species associated with crown rot of wheat in Turkey and screening wheat lines for their reaction to Fusarium culmorum. During summer 2013, samples were collected from 200 fields in the different agro-ecological regions of Turkey. Fungi were isolated from symptomatic crown/stem base tissues. The isolates were identified to species level using morphological and molecular methods. Morphological identification of Fusarium species was based on macro and microconidial morphology, phialide structure, mycelial characteristics, pigmentation on agar and growth rate using keys in Fusarium identification manuals. Molecular identification was carried out by sequencing the translation elongation factor-1 alpha (TEF-1α) gene region using primers ef1 and ef2. A total of 342 isolates representing 17 Fusarium species were isolated. The isolates were identified as F. culmorum, F. pseudograminearum, F. graminearum, F. equiseti, F. acuminatum, F. brachygibbosum, F. hostae, F. redolens, F. avenaceum, F. oxysporum, F. torulosum, F. proliferatum, F. flocciferum, F. solani, F. incarnatum, F. tricinctum, and F. reticulatum. Fusarium equiseti was the most commonly isolated species, accounting for 35.55% of the total Fusarium species isolated. Among the damaging species, F. culmorum was the most predominant species being isolated from 13.29% of sites surveyed while F. pseudograminearum and F. graminearum were isolated only from 0.87% and 0.29% of surveyed sites, respectively. All the 342 isolates belonging to the 17 Fusarium species were tested for pathogenicity on susceptible durum wheat cultivar Kızıltan-91 using agar disc inoculation method. Seven out of the 17 Fusarium species tested for their pathogenicity caused crown rot in different levels of severity. Fusarium culmorum, F. pseudograminearum and F. graminearum caused severe crown rot disease on durum wheat cultivar Kızıltan-91.ixFusarium avenaceum and F. hostae were moderately pathogenic. F. acuminatum and F. redolens were weakly pathogenic. On the other hand, F. oxysporum, F. equiseti, F. solani, F. incarnatum, F. reticulatum, F. flocciferum, F. tricinctum, F. brachygibbosum, F. torulosum and F. proliferatum were non- pathogenic. The result of aggressiveness test showed that Fusarium culmorum isolates differed in their aggressiveness on the susceptible durum wheat variety Kızıltan-91. The most aggressive Fusarium culmorum isolate Fc2 was used as inoculum to screen 165 spring wheat lines for their reaction. Thirteen percent of the lines tested showed promising and consistently resistant/moderately resistant reaction to Fusarium culmorum.