Mezenkimal kök hücre ekilmiş doku iskelesi destekli perfüzyon biyoreaktörlerle kemik doku mühendisliği

Tez Türü: Yüksek Lisans

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye

Tez Danışmanı: Menemşe Gümüşderelioğlu

Tezin Onay Tarihi: 2017

Tezin Dili: İngilizce

Desteklendiği Program: Diğer

Özet:

Bu çalışma, Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (Tübitak) Projesi No: 214M100 tarafından maddi olarak desteklenmiştir. Bu tez çalışmasında, durağan hücre kültürü ve dinamik yaklaşım olan perfüzyon biyoreaktörlerinde farklı ebat ve farklı boyuttaki doku iskelelerine dayanan hücre kültürü çalışmalarının insan mezenkimal kök hücreleri (hMSC) üzerindeki üreme ve osteojenik farklılaşmanın potansiyelinin araştırılması amaçlanmıştır. Deneysel çalışmaların ilk aşamasında, kitosan-hidroksiapatit süpergözenekli hidrojel (kitosan-HA SGPH) doku iskeleleri, köpükleşme ajanı olarak sodyum bikarbonat (NaHCO3) ve çapraz bağlayıcı olarak glioksal kullanılarak hazırlanmıştır. Mikrodalga destekli gaz köpükleşme tekniği, in vitro çalışmalarda yüksek verim ve daha yüksek tekrarlanabilirlik elde etmenin yanında doku iskelelerinin üretiminin hızlandırılmasını desteklediğinden tercih edilmiştir. Deneysel çalışmanın ikinci aşamasında, olası bir sızıntının önlendiği ve besin maddeleri / atık madde difüzyon sorunlarının çözülebildiği, uzun vadeli dinamik kültür çalışmaları ile sürdürülebilir sterilite sağlayan perfüzyon biyoreaktör sisteminin kurulumu gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın bir sonraki safhasında, hMSC'ler kullanılarak farklı akış hızlarında ve farklı boyutlarda doku iskeleleriyle (P3D-6: 0.1 mL/dk, P3D-6: 0.2 mL/dk; P3D-10: 0.27 mL/dk) 21 gün süreyle dinamik hücre kültürü çalışmaları gerçekleştirilmiş ve kültürün 3, 6, 9, 12, 15 ve 18. günlerinde ortam değişiklikleri yapılmıştır. Hücre kültürü çalışmalarının 7, 14 ve 21. günlerinde hücre canlılığı ve çoğalmasını gözlemlemek için MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) analizi gerçekleştirilmiş ve SEM (Taramalı Elektron Mikroskopisi) analizi ile hücre morfolojileri ve penetrasyonları gözlemlenmiştir. Hücre kültürü çalışmalarının sonunda insan mezenkimal kök hücrelerinin Kolajen1 (COL1), Runt İlişkili Transkripsiyon Faktörü 2 (RUNX2), Osteokalsin (OCN) ve Osteopontin (OPN) ekspresyon düzeylerini belirlemek için RT-PCR (Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu) analizi yapılmıştır. Tez çalışmasının son bölümünde, perfüzyon biyoreaktörde akış ve kütle transferi simülasyon çalışmaları COMSOL yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Modelin doğruluğu, doku iskelesi olmayan bir biyoreaktörde düşük ve yüksek akış hızı uygulamaları için geliştirilen modellerle test edilmiştir. Ardından, farklı akış hızlarında ve farklı boyutlarda üretilmiş olan geçirgen doku iskeleleri varlığında perfüzyon biyoreaktörün akış modeli ve kütle transferi modeli ortaya konulmuştur. Tez kapsamında yapılan hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) modelleme çalışmalarından elde edilen sonuçların deneysel bulguları desteklediği görülmüştür. Tüm analizler ve bulgular ışığında perfüzyon biyoreaktöründe 0.1 ve 0.2 mL/dk akış hızı ve 3mm çapında ve 6mm yüksekliğindeki doku iskeleleri ile yapılan dinamik kültür yaklaşımının insan mezenkimal kök hücrelerinin osteojenik farklılaşmasını desteklediği gösterilmiştir. Buna ek olarak, CFD yaklaşımının, farklı çalışma parametreleri göz önüne alındığında, mühendislik ürünü kemik yamalarının in vitro üretiminde başarılı sonuçlar elde edilmesinde belirleyici faktör olduğu sonucuna varılmıştır.