TAL2 Transkripsiyon Faktörünün İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Beta Hücre Farklılaşmasında PAX4 Gen İfadesi Üzerindeki Düzenleyici Rolünün Moleküler Mekanizmalarla İncelenmesi

Proje Özeti: 

Diyabet, dünya genelinde 537 milyondan fazla kişiyi etkileyen ve Türkiye’de yaklaşık 9 milyon bireyde görülen, kronik ve progresif seyirli bir metabolik hastalıktır. Tip 1 diyabet (T1D), otoimmün mekanizmalar sonucu pankreatik beta hücrelerinin yok olmasıyla, Tip 2 diyabet (T2D) ise insülin direnci ile beta hücre fonksiyon kaybıyla karakterizedir. Her iki formda da fonksiyonel beta hücre eksikliği, hastalığın temel patofizyolojisinde belirleyicidir. 

Diyabetin bir tedavisi bulunmamakla birlikte, mevcut terapötik yaklaşımlar beta hücre fonksiyonunu desteklemeye ya da kaybedilen hücrelerin yerine konmasına yöneliktir. Hücre yenilenmesine dayalı tedavi stratejileri arasında allojenik Langerhans adacık nakli ile kök hücre türevli adacık benzeri yapıların üretimi öne çıkmaktadır. Özellikle T1D için, hastadan türetilen insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerden (human induced pluripotent stem cells: hiPSC) in vitro koşullarda fonksiyonel beta hücre farklılaştırılmasını amaçlayan protokoller, tedavi potansiyeli yüksek bir yaklaşım olarak dikkat çekmektedir. Bununla birlikte, farklılaşma protokollerinin verimliliğini artırmak ve elde edilen hücrelerin fonksiyonel olgunluğunu sağlamak amacıyla insan pankreas gelişiminin ve hücresel kader belirleyici mekanizmaların daha iyi anlaşılması gerekmektedir.

Bu bağlamda, Paired box 4 (PAX4) transkripsiyon faktörü, pankreatik beta hücre soyunun belirlenmesinde anahtar bir düzenleyici olarak bilinmektedir. Fare modellerinde ve insan genetik çalışmalarda PAX4’ün beta hücre gelişimi ile doğrudan ilişkisi gösterilmiştir. Ancak, PAX4’ün hücre içi düzenleyici ağ içerisindeki öncül (upstream) transkripsiyonel kontrol mekanizmaları halen tam olarak aydınlatılamamıştır. Doktora çalışmam sırasında gerçekleştirdiğim tek hücreli transkriptomik (single cell RNA-seq) ve kromatin erişilebilirlik (ATAC-seq) analizleri, TAL BHLH transkripsiyon faktörü 2 (TAL2) transkripsiyon faktörünü, PAX4 geninin olası doğrudan upstream düzenleyicisi olarak ortaya koymuştur. Bu projede, bu hipotezi test etmek amacıyla PAX4-Venus/C-peptid-mCherry çift raportörlü (dual reporter) hiPSC hattı geliştirilmiştir. Bu hücre sistemi, hem PAX4 transkripsiyonel aktivitesinin canlı hücre düzeyinde doğrudan izlenmesine hem de beta progenitör (PAX4-Venus pozitif) ve olgun beta hücrelerinin (C-peptid-mCherry pozitif) ayrımına olanak sağlamaktadır. 

Projede, TAL2 merkezli yeni bir gen düzenleme ağının ortaya konması ve bu ağın pankreatik gelişim ile beta hücre farklılaşmasındaki etkisinin anlaşılması hedeflenmektedir. Bu kapsamda, TAL2 geni lentiviral vektörler aracılığıyla kontrollü olarak aşırı ifade (overexpression) ettirilecek, ardından hücreler beta hücrelere farklılaştırılacak ve bu süreçteki etkileri detaylı olarak analiz edilecektir. Farklılaşma süreci boyunca elde edilen hücreler akım sitometrisi, immünofloresan boyama ve konfokal mikroskopi ile değerlendirilecek, farklılaşmanın evrelerine özgü gen ekspresyon profili kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) ile analiz edilecektir. Ayrıca, TAL2’nin PAX4 üzerindeki doğrudan transkripsiyonel düzenleyici etkisi, kromatin immünopresipitasyon analizleri (ChIP-qPCR ve ChIP-sekanslama) ile incelenecektir. Elde edilecek bulgular, hiPSC kaynaklı beta hücre üretiminde farklılaşma verimini (mevcut: %40’tan hedeflenen: %60–70’e) ve hücre popülasyonunun homojenliğini artırmaya yönelik protokol optimizasyonlarına katkı sağlayacaktır. 

Sonuç olarak, bu proje, TAL2'nin insan beta hücre farklılaşmasındaki rolünü ve PAX4 üzerindeki transkripsiyonel kontrolünü sistematik biçimde inceleyerek hem moleküler diyabet araştırmalarına özgün katkılar sunmayı hem de Türkiye'de hiPSC tabanlı tedavi yaklaşımlarına yönelik sürdürülebilir bir araştırma hattının oluşumunu desteklemeyi amaçlamaktadır. Ayrıca bu projenin bağımsız bir araştırma çizgisi geliştirmem açısından da önemli katkısı olacaktır. İleri düzey moleküler biyoloji ve epigenetik teknikler konusundaki yetkinliğimin artması yanında, Lickert Laboratuvarı ile süregelen uluslararası iş birliğimi güçlendirerek ve Ankara Üniversitesi Kök Hücre Enstitüsü bünyesinde hiPSC tabanlı pankreatik beta hücre üretimi alanında yeni bir araştırma hattının oluşumuna katkı sağlayacaktır.