Akademik Veri Yönetim Sistemi
GÜRDAL H. (Yürütücü)
TÜBİTAK Projesi, 1001 - Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Projelerini Destekleme Programı, 2017 - 2020
Meme kanseri hücreleri HER-2 (insan
epidermal büyüme faktör reseptörü 2), östrojen ve progesteron reseptörlerini
bulundurmalarına göre farklı guruplara ayrılmaktadır. Ayrıca bu reseptörlerin
hiçbirini bulundurmayan meme kanseri hücreleri, üçlü-negatif meme kanser hücreleri
olarak tanımlanmaktadır. Üçlü negatif meme kanser hücreleri tedaviye en
dirençli grubu teşkil etmektedir. Bu
hücreler yüksek düzeyde beta-adrenerjik reseptör (b-AR) içermektedir.
Tamamlamış olduğumuz bu projede daha önceki projemizde MDA-MB-231 meme kanser
hücrelerinde gözlemlemiş olduğumuz beta-adrenerjik reseptörlerin (b-AR) uyarılması ile gözlemlenen proliferasyonu azaltıcı etkinin
mekanizmaları ve diğer üçlü negatif meme kanserilerinde gözlemlenen bu etkinin
var olup olmadığı araştırılmıştır. Proje amaçları doğrultusunda b-AR’lerin kanser ile ilişkili olan
ve olmayan fizyolojik/fizyopatolojik etkileri üçlü negatif meme kanser
hücrelerinde açıklığa kavuşturulmuştur. Öncelikle b-AR siteminin cAMP ve bağlantılı olarak protein kinaz A (PKA)
yolağının önemli olabileceği düşünülmüştür. Yapılan çalışmalar sonucunda PKA
inhibisyonunun b-AR aracılı antiproliferatif
yanıtı engellemediği hatta hafif arttırdığı ayrıca MCF12A gibi daha yavaş
büyüme hızı olan kontrol meme hücrelerinde b-AR uyarısının hücre proliferasyonunu arttırdığı ve PKA
inhibisyonunun bu artışı engellediği gözlemlenmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda
b-AR uyarısı aracılı cAMP ve PKA yolağının
antiproliferatif etkinliğe aracı olamayacağı aksine bu yolağın proliferasyonu
artırıcı yönde etkisinin olabileceği sonucu çıkarılmıştır. Ayrıca diğer bir
üçlü negatif kanser hücresinde, BT-20, b-AR uyarısının
etkisi araştırılmış ve MDA-MB-231 hücrelerinde görülenin aksine bu hücrelerde b-AR uyarısının proliferasyonu hafif arttırdığı gözlemlenmiştir. Bu
sonuçlar doğrultusunda b-AR
uyarısının bu hücrelerde iki farklı karşıt sinyale aracılık ettiği suonucuna
varılmış ve cAMP-PKA yolağının proliferasyonu artırıcı yolak olduğu düşünülerek
antiproliferatif etkinlikte b-AR‘in
diğer önemli yolağı olan beta-arrestin’lerin (bArr) rolünün araştırılmasına yönlenilmiştir. Bu proteinlerin
rolünü anlamak için hücre düzeyindeki ifadeleri siRNA transfeksiyonu ile
azaltılmış ve cDNA transfeksiyonu ile artırılmıştır.
bArr1
ve 2’nin ifadesi MDA-MB-231 ve MDA-MB-468 hücrelerinde siRNA ile azaltıldığında
hücre proliferasyonunda ve hücrelerin invazyonunda artış gözlemlenmiş ve bArr uyarısı ile MDA-MB-231 hücrelerinde gözlemlenen
antiproliferatif etki gözlemlenememiştir. bArr1 ve 2’nin ifadesi MDA-MB-231 ve MDA-MB-468 hücrelerinde cDNA
transfeksiyonu ile artırıldığında ise belirgin bir şekilde antiproliferatif
etki gözlemlenmiş ve hücrelerin invazyonu inhibe olmuştur. Bu sonuçlar
doğrultusunda bArr1 ve 2’nin antiproliferatif
ve antikanser etkinliğe aracılık edebileceği sonucuna varılmış ve MDA-MB-231
hücrelerinde bu proteinlerin ifadeleri artırılarak antiproliferatif/antikanser etkinliğin
moleküler mekanizmaları aydınlatılmaya çalışılmıştır. Yapılan mikroarray
çalışmaları sonucunda bArr1 ve
2’nin ifadesinin artırılması yapılan yolak analizinda hücre siklus, p53 ve
Jak-stat sinyal yolak genlerinin düzeylerinde farklı ifadeler (differential
expression) saptanmıştır. Özellikle hücre siklusunda önemli olan CDC45, BUB1, CCNB1, CCNB2, CDKN2C gibi genlerin ifadesinde
farklılıklar görülmüş bu farklılıklar qRT-PCR yapılarak geçerlilikleri test
edilmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda bArr1
ve 2’nin ifadesinin arttırıldığı hücrelerde flow sitometri deneyleri
yapılarak hücre siklus fazları ve apoptozis değerlendirilmiştir. Bu deneyler
sonunda bArr1 ve 2’nin ifadesinde
artışı ile apoptozis olmadığı fakat S fazında uzama, G2 fazında kısalma ve S
faz duraklamasının (arrest) olduğu görülmüştür. bArr1 ve 2’nin ifadesinin artışı ile gözlemlenen
antiproliferatif/antikanser etkinlikte hücre siklusunda de gözlemlenen bu
değişikliğin olabileceği sonucuna ulaşılmıştır.
Diğer taraftan bArr1 ve
2’nin ifadesinin artışı ile gözlemlenen invazyonu engelleyici etkinin
mekanizmasını aydınlatılması amacı ile bu yolakta önemli olabilecek
moleküllerin düzeyi saptanmıştır. Yapılan çalışmalar sunucunda HER3, IGF-R1 ve
Snail protein düzeylerinde bArr1
ve 2’nin ifadesinin artışı ile azalma olduğu ve bunun hücre hareketlikliğinde
gözlemlenen yavaşlamanın altında yatan faktörlerden olabileceği düşünülmüştür.
Bu projenin
diğer bölümünde önceki çalışmalarımızla gözlemlemiş olduğumuz b-AR
aracılı pEGFR/pERK1/2 de-fosforilasyonlarına aracı olan protein fosfataz 1 (PP1)
ve dual-spesifik serin/threonin fosfataz 1’in (DUSP1) rolü araştırılmıştır. Bu
çalışmalar doğrultusunda öncelikle DUSP1 enzimi ve PP1 enziminin ifade
düzeylerinin siRNA ila azaltılmıştır. Bu enzimlerin azaltılması ile b-AR
aracılı pEGFR/pERK1/2 de-fosforilasyonunun kısmi azalmaya neden olduğu fakat
tamamen ortadan kalkmadığı görülmüştür. Ayrıca DUSP1 veya PP1A düzeyinin
azaltılması MDA-MB-231 hücrelerinin çoğalmasını inhibe etmiş ayrıca bu
hücrelerde gözlemlenen b-AR aracılı hücre çoğalmasındaki azalmayı engellemiştir.
Bu sonuç bize DUSP1 ve PP1A enzimlerinin antikanser etkinlik için bir hedef
olabileceklerinin ve ayrıca b-AR aracılı yanıtta aracı
olabileceklerini göstermiştir. Bu enzimlerin düzeyi artırıldığında DUSP1
enziminin artışı ile hücre çoğalmasında hafif artış PP1A enziminin artışıyla
bir azalma gözlemlenmiştir. Ayrıca bu enzimlerin düzeyinin artırılması b-AR
aracılı hücre çoğalmasındaki azalmayı değiştirmemiştir.
Özet olarak bu proje ile; b-AR uyarısının
triple negatif meme kanser hücre tipine göre çoğalmayı azaltabileceği veya
artırabileceği ve dolayısıyla iki farklı sinyale aracılık edebileceği
gözlemlenmiştir. b-AR’ün altında yer alan sinyal yolaklarından,
Gs-cAMP-PKA yolağının hücre çoğalmasını artırıcı yönde etkinlik göterebileceği,
bArr1 ve 2 proteinlerinin antikanser ve
çoğalmayı azaltıcı etkinlik gösterebileceği sonucuna ulaşılmıştır. Ayrıca DUSP1
ve PP1A fofatazların MDA-MB231 hücrelerinde gözlemlenen çoğalmayı azltıcı
etkinlikte rol aldıkları gösterilmiştir. Diğer önemli sonuç ise bu proteinlerin
bazı üçlü negatif meme kanserlerinde antikanser
etkinlik için bir hedef olabileceklerinin gösterilmesidir. Tamamlamış olduğumuz
in vitro çalışmalrın sonuçları doğrultusunda in vivo kanser modellerinde
antikanser etkinliğin araştırılması kaçınılmazdır.