DETERMINATION OF BIOACTIVE PEPTIDE PRODUCTION POTENTIALS OF LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM SOME TRADITIONAL DAIRY PRODUCTS

ISMAIL TIJJANI KABWANGA

DETERMINATION OF BIOACTIVE PEPTIDE PRODUCTION POTENTIALS OF LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM SOME TRADITIONAL DAIRY PRODUCTS

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, SÜT TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2023

Tezin Dili: İngilizce

Öğrenci: ISMAIL TIJJANI KABWANGA

Danışman: Şebnem Budak

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Laktik asit bakterilerinin (LAB) biyoaktif peptitleri meydana getirme yeteneği, bakteri suşuna ve süt işleme koşullarına bağlıdır. Bu çalışmada, çeşitli LAB izolatları ile üretilen fermente sütte pH, asitlik, canlı bakteri sayısı ve suda çözünür peptit profillerinin analizleri yapıldı. Fonksiyonel aktiviteler için antioksidan, fenolik aktivite, antimikrobiyal ve ACE inhibitör özellikleri depolamanın 1., 14. ve 28. günlerinde incelenmiştir. Tüm test ölçümleri ikişer tekrar halinde gerçekleştirildi. Varyans analizi Minitab yazılımının 17. versiyonu (State College, ABD) kullanılarak yapıldı. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verildi. Depolama günleri ve farklı LAB starter kültürleri arasındaki önemli farklılıklar %95 güven düzeyinde olan Tukey testi (P≤ 0.05) kullanılarak ölçülmüştür. Lactobacilli suşları 37 °C'de, Lactococci, Streptococci ve Enterococci ise 30 °C'de inkübe edilmiş ve 4.70-4.80 pH aralığı elde edildiğinde inkübasyon sonlandırılmıştır. Fermente süt örneklerinde pH değerleri 3.88-4.81-arasında bulunmuştur. Sonuçlara göre, Lb. bulgaricus 23 ve Lb. helveticus 11-B2 ile üretilen fermente süt örnekleri depolama süresi sonunda en düşük pH değerini gösterirken, Lc. lactis NCCB 100539 örneği depolamanın hem 1. hem de 28. gününde en düşük pH değerlerini göstermiştir. Lb. helveticus 11-B2, Lb. helveticus 9-B5, Lb. helveticus 12-B1 ile üretilen örnekler diğer LAB türlerine göre daha kısa fermantasyon süresine (3-4 saat) sahip bulunmuştur. Tüm fermente süt örneklerinin ortalama titre edilebilir asitliği laktik asit cinsinden %0.16-1.52 laktik asit arasında tespit edilmiştir. Lb. bulgaricus 23 ve Lb. helveticus 11-B2 ile üretilen örneklerde en yüksek titre edilebilir asitlik değerlerine depolamanın 28. gününde ulaşılmıştır. Canlı mikrobiyal sayım, yayma plak yöntemiyle gerçekleştirilmiştir. Canlı mikrobiyal sayım sonuçlarına göre, laktobasil örneklerinin canlı bakteri sayısı 8.2-11.1 log KOB/mL arasında tespit edilmiştir. S. thermophilus K16 depolamada en yüksek canlı mikrobiyal sayıya sahipken, Lb. bulgaricus 23 örneği en az canlılık göstermiştir. Suda Çözünen Azot (SÇA) protein degeri, Qubit™ 4 Florometre yöntemi kullanılarak ölçülmüştür. SÇA'nın pH 4.6'daki ortalama protein miktarı, fermente süt örnekleri arasında önemli ölçüde farklılık göstermiştir (P≤0.05). Örneklerimizdeki SÇA protein içeriğinin ortalama değeri 0.106 ile 0.390 mg/mL arasında değişmiştir. Lb. helveticus 9-B5 en yüksek SÇA protein miktarı içerirken (0.390 mg/mL), Lb. paraplantarum NCCB 100524'ün ise en düşük SÇA protein değerine sahip oldugu gözlenmiştir. Peptit profili RP-HPLC kullanılarak belirlenmiş ve sonuçlar proteoliz seviyesinin 28 günlük depolama sırasında giderek arttığını göstermiştir. Farklı bakterilerle üretilen örneklerde depolama günlerinde SÇA'da pik sayıları ve pik yükseklikleri açısından farklılıklar gözlenmistir. En yoğun pikler, E. faecium NCCB 100527, E. faecalis NCCB 100525, Lb bulgaricus 23 ve Lb. paraplantarum NCCB 100524 ile üretilen örneklerde belirlenmiştir. Bu durum bahsedilen suşların daha yüksek proteolitik aktivite göstermesi ve dahil edildikleri fermente sütlerde daha fazla biyoaktif peptit üretme potansiyelinde olabileceği şeklinde yorumlanmıştır. Ancak Lb. helveticus 9-B5, Lb. helveticus 11-B2 ve Lb. helveticus 12-B1 ile üretilen fermente süt örnekleri, diğer örneklere göre daha küçük ve daha az pik göstermiştir. Depolama sonunda L. plantarum NCCB 100523 ile üretilen örnek en az sayıda ve düşük yükseklikte pikler üretmiş, bunu sırasıyla E. faecium NCCB 100527 ve S. thermophilus 1-K4 ile üretilen örnekler izlemiştir. S. thermophilus 1-K4, Lb. helveticus 9-B5, Lb. helveticus 11-B2 ve Lb. helveticus 12-B1 ile fermente sütün örneklerinin hidrofobik bölgesinde önemli bir pik artışı tespit edilmemiştir. Farklı LAB suşları ile üretilen fermente süt örneklerinde oluşan peptitlerin biyoaktivitelerinin belirlenmesi kapsamında küçük molekül ağırlıklı peptit fraksiyonları (<3 kDa) ayrılarak analiz edilmiştir. Antioksidan aktiviteyi analiz etmek için DPPH yönteminden yararlanılmıştır. Ölçülen absorbanslar UV/VIS spektrofotometresi ile 517 nm'de belirlenmiş ve sonuçlar M Trolox eşdeğer antioksidan kapasitesine (M TEAC) dönüştürülmüştür. Sonuçlara göre tüm örneklerin antioksidan aktivite değeri 152.3-1935.2 M TEAC arasında değişmektedir. Örnekler arasında ortalama DPPH değerinde önemli farklılıklar olduğu gözlenmiştir (P ≤ 0.05). S. thermophilus K16 içeren fermente süt örnekleri, depolama günleri boyunca en yüksek antioksidan aktivite gösteren örnekler olarak belirlenmiş ve bunu E. faecium NCCB 100527 ile üretilen örnek takip etmiştir. En düşük antioksidan aktivite 1. günde Lb. paraplantarum NCCB 100524 ile yapılan örneklerde ve depolamanın 14. ve 28. gününde Lb. brevis NCCB 100526 ile üretilen orneklerde gözlenmiştir. Toplam fenolik madde ölçümü Folin-Ciocalteu yöntemi kullanılarak UV/VIS spektrofotometre ile 760 nm'de ölçüm yapılarak belirlenmiştir. Toplam fenolik madde içeriklerin sonuçları, mg gallik asit eşdeğerleri (GAE/g) cinsinden hesaplandı. Fermente süt örneklerinde toplam fenolik madde içeriği 10.68-35.61 arasında değişmektedir. Lb. brevis NCCB 100526 ile yapılan örnekler, depolama günleri boyunca en yüksek fenolik içeriği üretirken ve bunu S. thermophilus K16 ile yapılan örnekler izlemiştir. Ancak Lb. paraplantarum NCCB 100524 ile yapılan fermente süt örnekleri tüm örnekler arasında en az fenolik madde içeriğinde belirlenmiştir. Fermente süt örneklerinin ACE inhibisyon aktivitesi RP-HPLC kullanılarak belirlenmiş ve sonuçlar yüzde olarak verilmiştir. Genel olarak ACE inhibisyon aktivitesi %40.48-117.81 arasında değişmektedir. Sonuçlara göre, Lb. paraplantarum NCCB 100524 ile üretilen örnek, 28. günde en yüksek ACE inhibisyon aktivitesi gösterirken, S. thermophilus K16 ile hazırlanan örnek depolamanın 1. gününde tüm numuneler arasında en yüksek ACE inhibisyon aktivitesini göstermiştir. Antibakteriyel aktivite, farklı patojen bakterilere karşı (Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella enterocolitica (ATCC 14028), Bacillus cereus (ATCC 14579), Mycobacterium tuberculosis (ATCC 7644), Enterococcus faecalis (ATCC 29212) Brain Heart Infusion (BHI) agar kullanılarak agar-kuyucuk yöntemi ile belirlenmiştir. Negatif kontrol olarak steril su kullanılmıştır. Antibakteriyel aktivite, inhibisyon bölgesinin alanı (mm) cinsinden ölçülmesi ile belirlenmiştir. Lb paraplantarum NCCB 100524 içeren fermente süt örnekleri depolamanın 28. gününde Escherichia coli'ye (ATCC 25922) karşı en yüksek inhibisyonu göstermiş, L. plantarum NCCB 100523 ile üretilen örnekler ise, depolamanın 1. gününde Mycobacterium tuberculosis'e (ATCC 7644) ve depolamanın 28. gününde Bacillus cereus 'a (ATCC 14579) karşı en yüksek inhibisyonu göstermiştir. Çalışmada ülkemize özgü (endemik) suşların süt endüstrisinde ticari kültürlere alternatif olarak kullanım potansiyelleri ve kullanımları durumunda üründe oluşabilecek biyoaktif peptit düzeyleri ile ürünün fonksiyonel özellikleri üzerine sağlayacakları katkılar hakkında ön fikir edinilmiştir. S. thermophilus K16, Lb. helveticus 11-B2, E. faecium NCCB 100527 ve Lb. brevis NCCB 100526 suşları biyoaktif peptit üretim potansiyeli bakımından en umut vadeden türler olarak kabul edilirken, S. thermophilus 1-K4 ve Lb. coryniformis NCCB 100528 ile üretilen örnekler analiz edilen fonksiyonel özellikler bakımından en düşük değerleri göstermiştir. Lb. bulgaricus 23, Lb. helveticus 11-B2, Lb. helveticus 9-B5, Lb. helveticus 12-B1, S. thermophilus 1-K4 suşları irdelenen teknolojik özelliklerden biri olarak yüksek asitlik üretme özelliğinde bulunmuştur. Sonuç olarak; analiz edilen tüm suşlar arasından hangi LAB'ın üründe daha fazla fonksiyonel etki yaratacağı ve ürünün irdelenen teknolojik özellikleri üzerine etkileri bu çalışma ile belirlenmiştir. Bu sonuçlar çerçevesinde fonksiyonel süt ürünleri endüstrisinde antioksidan aktivite, fenolik içerik, ACE-inhibitör aktivite ve antimikrobiyal aktivite gibi değerlendirilen fonksiyonel etkiler bakımından ürün kalitesini arttıracak aday kültür olarak kullanılabilecek türlerin ve daha yüksek biyoaktif peptit üretme potansiyelinde olabilecek suşların da ön bilgisi edinilmiştir. S. thermophilus K16 ve E. faecium NCCB 100527 ile üretilen örnekler antioksidan aktivite kapasitesi en yüksek suşlardır. Lb. brevis NCCB 100526 ve S. thermophilus K16 ile üretilen örnekler toplam fenolik içeriği bakımından en iyi suşlar olarak tespit edilmiştir. Lb. paraplantarum NCCB 100524, L. plantarum NCCB 100523, Lb. helveticus 11-B2 ve S. thermophilus K16 ile üretilen örnekler en iyi ACE inhibisyon aktivitesini gösteren suştur. Bu 6 suş, aynı zamanda entegre edildikleri fermente sütlerde belirlenen peptit profil kromotagramı hidrofobik bölgelerinde en yoğun piklerin tespit edildiği suşlardır. Bu durum, bu suşların fonksiyonel özelliklerinin yüksek olması ile bağdaştırılabilir.